Préparation des échantillons

L’analyse des échantillons par microscopie électronique ne peut se faire sans une préparation spécifique selon la nature de l’échantillon. Cette préparation dépend également de ce qui est recherché, allant de l'analyse ultrastructurale au MET au balayage de la surface de l’échantillon au MEB.

Préparation classique des échantillons destinés à l’analyse au microscope électronique à balayage (MEB)

Le traitement classiquement proposé pour les échantillons biologiques consiste en une fixation au glutaraldéhyde pour préserver les tissus, un traitement à l’OsO4 pour renforcer le signal et apporter du contraste, ainsi qu'une déshydratation pour optimiser l'analyse dans une enceinte sous vide. L’échantillon est ensuite métallisé en surface à l’or palladium ce qui améliore la conductivité électrique et l'écoulement de charges. Le degré de déshydratation dépend du volume de l'échantillon. Les échantillons massifs comme les échantillons veineux ou artériels requièrent une dessication sous vide et un contournement du point critique au CO2 liquide. Les échantillons moins volumineux seront traités par une série de bains d’alcools puis un bain HMDS. Ils sont ensuite métallisés à l’or palladium. Certains échantillons, comme les fibres capillaires, ne nécessitent qu’une métallisation.

Les polymères sont surfacés par ultracryomicrotomie puis sont métallisés en surface à l'or palladium. Les pièces métalliques, peuvent être directement fixés sur un plot préparé avec du scotch de carbone sans traitement spécifique.

Nous proposons une analyse qualitative de la surface des échantillons par microanalyse X.  Si l'échantillon n'est pas plan, un cryosurfaçage est recommandé au préalable.

Préparation classique des échantillons destinés à l’analyse au microscope électronique transmission (MET)

Les tissus biologiques requièrent une fixation pour la préservation de l'ultrastructure, un traitement à l’OsO4 pour améliorer le signal et le contraste, ainsi qu'une déshydratation. Les tissus sont ensuite positionnés dans des moules puis inclus dans de une résine de type EPON qui polymérise à 60°C. Les cellules sont en général préparées dans des tubes eppendorf puis inclus en gélule. Un protocole spécifique est disponible pour les cellules rares.

L’échantillon pris dans la résine dure forme un bloc très dur. Des coupes ultrafines sont réalisées par utramicrotomie à température ambiante. Ces coupes sont déposées sur des grilles de cuivre. Après un traitement à l'uranyless et au citrate de plomb pour renforcer le contraste les coupes sont prêtes. Les grilles sont déposées sur le porte-objet du microscope électronique en transmission. L'observation de l'échantillon se fait à fort grandissement et à haute résolution (de l’ordre du nanomètre).

Les échantillons biologiques liquides (plaquettes sanguines, exosomes dans l’urine, solution virale) peuvent également être analysés après un traitement à l’uranyless (coloration négative) Cette technique est relativement simple et rapide. Elle est particulièrement intéressante pour l’étude des bactéries et est très utilisée pour la détection de virus.

Les polymères sont également observables au MET. Les polymères ne nécessitent pas de traitement chimique. Ils sont positionnés dans un ultracryomicrotome refroidi à l’azote liquide pour la réalisation de coupes ultrafines. Les coupes sont déposées sur une grille de cuivre. Un traitement aux vapeurs d’OsO4 peut-être proposé pour renforcer le contraste avant l’observation des coupes au MET.